2.1检测平台

生化学检测：

项目成员在国际上首次发现顽固性便秘、溃疡性结肠炎、克罗恩氏病的致病菌的同时，通过色谱分析、质谱分析以及蛋白纯化等各种分析技术，找到了顽固性便秘的致病因子以及溃疡性结肠炎（克罗恩氏病正在确认阶段）的致病毒素，由此通过多方尝试，研制了生化学和免疫学检测方法，已经成功建立HPLC法检测顽固性便秘致病因子DPA以及抗体金法检测溃疡性结肠炎致病KFQ毒素。

采用HPLC法检测DPA致病因子：

检测仪器为Agilent 1200等

检测原理：高效液相色谱法（HPLC）是一种用于分离、鉴定和量化混合物中的各组分的分析技术，利用C18色谱柱以及梯度流动相对提取得到的有机物进行分离，然后用紫外检测器同时检测DPA标品和样品，最后进行DPA鉴定和定量。

免疫学检测：

检测方式：抗体金法

检测原理：胶金法是一种基于免疫学原理的检测方法，自建KFQ毒素的单克隆抗体和多克隆抗体，与检测样品中的抗原结合，形成胶体金颗粒沉淀，通过比较样品与对照样品的颜色变化，从而实现对溃疡性结肠炎致病毒素的精准检测，以此来判断样本的溃疡性结肠炎特异致病菌感染可能。胶金法具有快速、简便、灵敏度高等优点，可以在短时间内对大量样本进行检测。

2.2粪便DPA测定

a背景

顽固性便秘致病菌发现后，经过层层筛选分析，团队还发现关键成果：PIB分泌致病因子DPA抑制肠蠕动，并能够存在于顽固性便秘患者粪便中，以此，研发HPLC法检测粪便中的DPA致病因子，作为判定顽固性致病菌感染的另一个关键辅助指标。

b检测方法

采用HPLC法检测DPA致病因子：

检测仪器为Agilent 1200等

检测方法：利用C18色谱柱以及梯度流动相对粪便样本中提取得到的有机物进行分离，然后用紫外检测器同时检测DPA标品和样品，最后进行DPA鉴定和相对定量。

c样品提供方法

粪便样本采集：对粪便的基本要求是：重量>1-2克、新鲜样本。

1、取样需新鲜，因此排便时先准备保鲜膜或袋备用。

2、用保鲜膜或袋盛放粪便，并挖取两块蚕豆大小块状粪便。

3、分别放入白色圆柱状取样器中，储于低温冰箱或寄回。

d 结果判读

HPLC法检测结果判读：具有DPA特征峰的样品，判读为具有顽固性便秘特异菌毒素分泌，可反推顽固性便秘致病菌PIB感染，而不含DPA特征峰的样品判读为无致病毒素分泌，可进一步用探针法荧光定量PCR进行核实，再判定有无PIB菌感染。

e常见问题解答

问：已经用探针法荧光定量PCR检测没有菌感染，是否就不需要再进行DPA确认？

答：还是需要DPA检测，以为样品储存等因素可能会导致菌体死亡，因此结合DPA检测双重确认才能排除顽固性便秘PIB感染。

问：PIB菌和DPA检测必须要一起做吗？

答：非必须，如果已经用一种方法检测到，则基本可以确认感染，当然想再次确认也可以检测两个。但如果有一种方法没有检测出则需要另一种方法辅助确认，两者都是阴性结果方能判读无感染PIB菌。

2.3溃疡性结肠炎致病毒素检测

a背景

溃疡性结肠炎

团队在发现溃疡性结肠炎致病菌的同时，另一个突破性成果是成功找到致病菌KFQ毒素，并研制出免疫学检测KFQ毒素方法，通过对临床确诊溃疡性病人进行检测，发现90%以上的符合率。

b检测方法

胶体金检测试剂盒检测粪便中特异性蛋白肽，自建KFQ毒素的单克隆抗体和多克隆抗体，与检测样品中的抗原结合，形成胶体金颗粒沉淀，通过比较样品与对照样品的颜色变化，从而实现对溃疡性结肠炎致病毒素的精准检测。

c样本提供方法

粪便样本采集：对粪便的基本要求是：重量>1-2克、新鲜样本。

1、取样需新鲜，因此排便时先准备保鲜膜或袋备用。

2、用保鲜膜或袋盛放粪便，并挖取两块蚕豆大小块状粪便。

3、分别放入圆柱状取样器中，储于低温冰箱或寄回。

d判读（检测）方法：

将样本加入到试剂盒中，与试剂盒中的抗体结合。如果样本中存在致病KFQ毒素抗原，则会与试剂盒中的抗体结合，形成胶体金颗粒沉淀，接着，将试剂盒中的沉淀与显色剂混合，使胶体金颗粒呈现出可见的颜色变化，从而形成测试条带和阳性检测条带，出现两条带的结果，则判读为存在毒素，推断样本中有KFQ菌感染，而只出现测试条带，无阳性条带，则判读为无毒素存在，需要再结合PCR结果判断KFQ菌的感染。

2.4其他

克罗恩氏病标志性产物的检测（确认和完善中）

肠息肉的小分子检测（确认和完善中）

肠息肉发生率 30-40%，目前主要用肠镜检测，手术切除。本研究团队发现肠息肉与某小分子代谢产物密切相关，可提前预警性筛查，并用于诊断和治疗。